Techniques modernes de reproduction : OPU et ICSI

Par : Frederik De Backer

 

La reproduction du cheval est un sujet qui nous intéresse tous : détection des chaleurs de la jument, choix d’un étalon, commande de doses, saillie et enfin échographie de diagnostic de gestation constituent le cycle complet. Ces procédures, beaucoup d’éleveurs les maîtrisent mieux que leur déclaration d’impôts. Mais les déclarations fiscales ont évolué pour se faire désormais en ligne ce qui, pour certains, est clair comme de l’eau de roche mais, pour d’autres relève du cauchemar. Et je ne parle là que de la manière de remplir les formulaires ; pas de la somme à payer qui apparaît à la fin. 

Je ne m’étais jamais dit que la reproduction équine présentait une quelconque ressemblance avec nos déclarations d’impôts – de la monte naturelle à l’insémination artificielle (IA) et à la semence congelée, au transfert d’embryon, au clonage et, aujourd’hui, à la ponction d’ovocytes (OPU) et l’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde (ICSI).

Lorsque je vivais encore en Belgique, j’ai suivi de près cette évolution. Un vétérinaire / étalonnier / chercheur / pionnier a pris en marche le train du progrès et proposé la technique du transfert d’embryon. En bref : la jument est inséminée et, après la fécondation, huit jours environ après la saillie, les embryons sont récoltés par lavage utérin. Si l’on trouve un ou plusieurs embryons dans le liquide récupéré, ils seront transférés dans des mères porteuses dans l’espoir d’une gestation normale. Onze mois plus tard, vous l’avez deviné, on retrouve la porteuse suitée d’un poulain en pleine forme. Dans l’intervalle, la donneuse aura donné d’autres embryons ou, très vite après la récolte, aura repris sa carrière sportive. Il était si courant de parler de transfert d’embryon, c’était une pratique tellement répandue que cela me semblait la chose la plus naturelle du monde. Quand j’ai commencé à pratiquer des transferts moi-même, cela a été une grande réussite – du point de vue à la fois de la technique et de mes résultats personnels.

Enfin, jusqu’à ce que je vienne vivre aux Pays-Bas où l’on m’a souvent interrogé sur le sujet du transfert d’embryons. La première fois, j’y ai à peine prêté attention. Mais, au bout d’un moment, j’ai pris conscience du scepticisme et du manque d’information qui régnaient au nord de Moerdijk. « Fake news », pour utiliser un mot à l’ordre du jour.

Il se trouve que mon installation aux Pays-Bas a pratiquement coïncidé avec les l’apparition de l’OPU et de l’ICSI, la grande avancée suivante en matière de reproduction équine. Les 300 kms qui séparent le poumon vert d’Aalst du cœur d’Overijssel font que je n’étais pas là pour assister à cette dernière étape. Je n’avais pas grand-chose à dire de cette technique, de sa réussite, de ses risques, de ses avantages et de ses inconvénients. Donc, après avoir entendu quelques histoires négatives, voire tristes, j’ai jugé que le moment était venu de chercher à comprendre de quoi il retournait.

Cette quête m’a conduit jusqu’au professeur Peter Daels. Fraîchement diplômé de l’université de Gand, en 1984, il est parti aux USA, en Californie, faire son doctorat à l’université Davis. Par la suite, il est passé de la côte Ouest à la côte Est pour devenir professeur à l’université Cornell de New York. En 1997, il a travaillé un an à l’université d’Utrecht avant d’entrer à l’INRA (Institut National de Recherche Agronomique), près de Paris, pour faire de la recherche. Il a également travaillé au centre de reproduction équine Keros, en Belgique. Depuis 2012, il est rentré au bercail en qualité de professeur de reproduction équine à l’université de Gand.

Il m’a également présenté à la vétérinaire Katrien Smits qui m’a fait découvrir les aspects pratiques de l’ICSI. Le Dr. Smits s’est occupé du premier foal né d’une ICSI, né au Benelux en 2009. Elle est actuellement chercheuse en post-doctorat à l’université de Gand où elle perfectionne la technique de l’ICSI et cherche de nouvelles possibilités telles que la congélation d’ovocytes et l’analyse génétique d’embryons issus d’ICSI.

On parle généralement d’ICSI mais le terme recouvre en fait deux techniques différentes : l’OPU (ponction ovocytaire) et l’ICSI (Injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde) proprement dite. Mais on peut effectivement parler d’ICSI. L’OPU implique de récolter des ovocytes dans le corps de la jument. Cela se pratique sur des juments non gestantes par l’insertion d’une sonde dans le vagin. La jument reçoit une anesthésie péridurale, ce qui n’est pas totalement sans risque. La sonde, qui comprend un échographe et une aiguille high-tech, est maintenue contre la paroi du vagin. Cela permet à l’échographe de produire une image de l’ovaire qui est maintenu en place par voie rectale. Puis on pique l’aiguille à travers la paroi du vagin, la cavité abdominale et l’ovaire, jusque dans le follicule. Les follicules, qui sont en gros de simples sacs contenant du liquide et un minuscule ovocyte, sont percés à travers la paroi du vagin et vidés par aspiration avec l’aiguille. Parfois, un ovocyte reste collé à la paroi du follicule et, pour augmenter les chances de réussite, le follicule est lavé et la paroi grattée. Il faut savoir que, du point de vue de la terminologie, gratter et piquer signifient ici la même chose.

Idéalement, la jument présentée aura entre 15 et 20 ovocytes immatures dans l’ovaire. Pourquoi immatures ? Parce qu’ils sont beaucoup plus faciles à manipuler à ce stade. La manipulation des ovocytes à maturité est une affaire beaucoup plus délicate et, en règle générale, il faut les féconder assez vite.

Plus il y a d’ovocytes prêts, plus les chances de gestation sont grandes. Selon le professeur Daels c’est l’un des principaux avantages de l’ICSI. La ponction peut être planifiée au moment qui convient le mieux au programme de votre jument. Et, avant que vous la conduisiez au centre, votre vétérinaire peut l’échographier pour vérifier que cela vaut la peine de faire le déplacement. S’il n’y a pas suffisamment d’ovocytes en position, il est possible de reporter la ponction jusqu’à ce qu’il y ait assez de follicules.

Mais revenons à nos ovocytes qui, dans l’intervalle, ont été transportés au laboratoire où ils ont été retirés du liquide de lavage et examinés. Les meilleurs sont placés dans un incubateur où ils vont mûrir jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être fécondés.

Cela pourrait sembler assez simple mais la fécondation est en réalité un processus très compliqué et délicat.

Il consiste à prendre quelques ovocytes à maturité et une fraction de la dose de semence utilisée pour une insémination classique en frais ou en congelé que l’on réunit dans une boîte de Petri, chaque ovocyte flottant dans une goutte de liquide.

Le travail se fait alors au moyen d’un micromanipulateur, qui associe un microscope et deux bras robotisés. Tout le monde sait ce qu’est un microscope : il permet de voir de toutes petites choses très grossies. Ici, nous parlons de tailles de l’ordre de quelques micromètres (ou microns) – 1 micromètre correspondant à 0,000001 m.

Les bras robotisés sont équipés d’une pipette de maintien dans une main et d’une pipette d’injection dans l’autre. On actionne les deux instruments qui sont actionnés au moyen d’un joystick tout en regardant dans le microscope. Outre les mouvements qu’ils peuvent réaliser, les deux instruments sont équipés de fonction aspiration et expulsion. Si vous manquez de dextérité sur une console de jeux et que vous faites encore tomber des palettes de copeaux de bois de la chargeuse, n’y pensez même pas !

Reste maintenant à trouver l’ovocyte et à guider la pipette de maintien le long de celui-ci puis à utiliser la fonction aspiration pour maintenir l’ovocyte contre la pipette avant de l’empêcher de bouger quand vous voudrez procéder à l’injection. Vous savez, comme avec l’olive et le pique-olive. Cherchez ensuite un spermatozoïde motile, correctement formé et actif. Vous commencez par entraver son activité en cassant le flagelle de façon à ce qu’il ne puisse pas se sauver tout le temps. Puis aspirez-le dans la pipette d’injection et retournez à votre ovocyte.

Faites traverser la zone pellucide puis l’oolemme à la pipette pour injecter le spermatozoïde dans l’ovocyte. Mission accomplie : vous venez de féconder un ovocyte. Maintenant, reprenez à l’étape 1 pour féconder ceux qui restent.

Une fois que tous les ovocytes ont été fécondés, il faut les placer dans un autre incubateur à l’atmosphère différente. Ne faites pas d’erreur à ce stade ! En cassant le flagelle, vous avez libéré des substances chimiques qui vont déclencher les étapes suivantes du processus.

Les ovocytes humains et ceux des autres espèces animales sont relativement transparents, ce qui permet de surveiller facilement la division cellulaire. En revanche, les ovocytes équins sont sombres, ce qui rend cette surveillance beaucoup plus difficile.

Vous n’êtes pas du genre patient ? Eh bien ce n’est pas pour vous. Attendez !

Il faut maintenant sept à huit jours pour que l’ovocyte se transforme en embryon. Chaque ouverture de l’incubateur peut modifier l’atmosphère à l’intérieur et nuire à vos chances de réussite. A la fin du processus, deux options s’offrent à vous. Soit congeler les embryons, soit les implanter dans une jument porteuse. La recherche a montré que la congélation n’avait aucune influence sur le taux de survie des embryons. La congélation augmente la mobilité des embryons car elle permet de les transporter facilement dans le monde entier et vous donne la possibilité d’en faire ce que vous voulez.

Aujourd’hui, la technique de l’OPU s’est très largement répandue et beaucoup de centres en Europe proposent la ponction d’ovocytes. En revanche, la technique de congélation des ovocytes n’est pas encore très avancée ; il faut donc les féconder tout de suite. Comme nous l’avons dit plus haut, il est possible de les laisser mûrir dans l’incubateur et de les féconder ensuite. Mais si votre centre d’OPU ne pratique pas l’ICSI, il est également possible de transporter les ovocytes à température ambiante. Le transport n’a pas d’effet sur eux et ils pourront être placés en incubateur dans l’un des quelques centres d’ICSI qui existent en Europe. A vrai dire, leur état change si peu que l’on n’a pu établir aucune différence entre des ovocytes qui avaient été transportés et ceux qui avaient été placés en incubateur sur-le-champ.

Mais alors, si l’OPU est relativement courante, si les ovocytes sont facilement transportables et si vous êtes doté d’une bonne coordination main – œil et d’une certaine patience, cela ne doit pas être si difficile que cela de réussir ? Si ?

L’un des laboratoires européens a réussi à réaliser des ICSI à petite échelle. Les résultats ont été excellents, les clients étaient ravis : pas une ombre au tableau. Jusqu’à ce que, brusquement, la division cellulaire s’arrête et que la fécondation des ovocytes échoue tout bonnement. Le problème a duré quelques jours qui se sont transformés en semaines et en mois. On a cherché frénétiquement la cause de ce phénomène singulier. On a fini par consulter un expert qui a examiné tous les liquides, les savons, les désinfectants, qui a vérifié si la température affichée sur l’incubateur correspondait bien à la température réelle à l’intérieur, qui s’est intéressé à l’air ainsi qu’au laboratoire et à son environnement. Et c’est ainsi qu’il a conclu que, quelques mois plus tôt, le goudron de la route avait été refait dans les environs du laboratoire. Les gaz et substances libérés par cette opération avaient pénétré à l’intérieur et sans doute contaminé l’atmosphère ainsi devenue impropre à la fécondation. Cela vous donne une idée de la délicatesse de l’ICSI.

Donc, avant de tenter une ICSI dans votre salle de bains, pensez à enlever tous les parfums.

Pour me donner une idée claire du taux de réussite, on m’a fourni les chiffres suivants : sur une ponction de 12 follicules, on en récupère huit en moyenne ; sur ces huit, cinq continuent de mûrir et peuvent être fécondés, donnant à leur tour en moyenne deux embryons pouvant être implantés ou stockés dans l’azote liquide. Pour ce qui est de l’implantation, un taux de réussite de 65% est considéré comme normal. Donc nettement plus d’un embryon sur deux va donner un poulain.

Mais avant que quelqu’un vienne me voir sur un terrain de concours pour me raconter que son voisin a obtenu trois embryons et autant de poulains d’une seule ponction, permettez-moi de vous rappeler que ces chiffres sont des moyennes. Il existe toujours des exceptions qui confirment la règle, mais cela vous donne une idée assez juste de vos chances lorsque vous vous embarquez dans cette aventure.

Cela montre aussi que l’on peut exercer un certain contrôle sur l’OPU/ICSI. Pour en tirer le meilleur parti, il faut créer les conditions de départ les plus favorables possible. Afin d’optimiser vos chances de réussites avec l’OPU, mieux vaut reporter l’intervention jusqu’à ce que l’échographie révèle un nombre suffisant de follicules. Tout cela peut se pratiquer en dehors de la saison d’élevage traditionnelle ; il suffira de décongeler les embryons et de les implanter au moment voulu. Donc, en théorie, on peut faire en sorte d’implanter tous les embryons en avril pour que tous les poulains naissent en mars de l’année suivante au lieu d’avoir à veiller des poulinages durant tout le printemps et l’été. Le sevrage sera également simplifié puisque tous les poulains d’ICSI auront à peu près le même âge.

Pouvoir choisir le moment de l’implantation donne également plus de latitude pour le choix de la porteuse. Une jument à vous ou plutôt une du centre de reproduction ? Dans le cas d’un transfert d’embryon classique, on vous attribuera une jument disponible et au bon stade de son cycle, qui n’est pas forcément celle que vous auriez préféré.

Vous pouvez également opter pour l’étalon de votre choix et l’utiliser au moment qui vous convient. Inutile de raisonner comme pour une insémination en frais en tenant compte du calendrier de concours dudit étalon. Votre jument est en chaleurs et devrait être saillie maintenant, mais l’étalon n’est pas disponible pour cause de compétition ? Avec l’ICSI, peu importe. La semence est de qualité médiocre, voire de mauvaise qualité ? Il suffit d’un petit spermatozoïde motile.

Mettons que vous souhaitiez pratiquer davantage d’OPU/ICSI et que vous ayez besoin d’implanter 20 embryons au printemps suivant. Vous pouvez les répartir dans plusieurs centres : cela vous permettra de voir lequel a les meilleurs résultats. Cette technique change radicalement la donne en matière de pouvoir de décision, avec toutes les conséquences positives et négatives que cela peut avoir.

Bien. Revenons à l’élevage, et plus particulièrement aux juments porteuses. L’une des raisons pour lesquelles j’ai interrogé le professeur Daels est une conférence qu’il a donnée à l’université de Hasselt. Lors de cette conférence, il a énoncé un certain nombre de chiffres et de faits intéressants que j’aimerais partager avec vous. Certains les connaissent peut-être déjà tandis que d’autres y verront sans doute du blasphème.

Des travaux de recherche de grande ampleur ont été effectués en France à partir du suivi tout au long de leur vie de plus de 50 000 chevaux, du foal au cheval de sport, à l’étalon et à la poulinière. Il en est ressorti que le premier produit d’une jument avait des performances inférieures à la moyenne, la norme étant ce que l’on peut attendre du croisement du père et de la mère, l’étalon et la jument, à la fois en termes de performance et de développement physique. Ne tirez pas sur le messager : c’est ce que disent les chiffres et les chiffres ne mentent pas.

La première explication possible pourrait être la raideur et la taille de l’utérus, encore assez petit lors de la première gestation. Plus l’utérus et vaste, plus la zone qui peut servir à transmettre les nutriments et l’oxygène au placenta qui contient l’embryon est importante.

Les performances des 2e et 3e produits s’améliorent progressivement puis les performances par rapport à la moyenne se stabilisent/se normalisent.

Vers la fin de la vie de la jument, la qualité de ses produits diminue à nouveau. L’explication peut là encore être trouvée dans le même contexte. L’élasticité de l’utérus diminue et la paroi utérine peut aussi avoir été endommagée et porter des cicatrices.

Amsterdam, 1944, l’Hiver de la faim. Les hommes et les femmes avaient à peine le strict minimum pour survivre du fait des pénuries alimentaires de la guerre et beaucoup d’habitants ont péri. Les enfants à naître ont souffert avec les femmes qui les portaient. Aujourd’hui encore, on diagnostique chez ces gens des affections telles que diabète, maladies cardiovasculaires et  autres troubles pulmonaires ou rénaux. De graves carences au stade embryonnaire peuvent avoir des conséquences à vie. De même, les carences dont votre embryon souffrira auront des conséquences à vie sur le cheval ou la jument qu’il deviendra. Cela pourrait d’ailleurs bien être une des raisons du scepticisme de nombreux éleveurs vis-à-vis de l’ICSI. Les plus critiques rappellent souvent une situation qui s’est produite chez des vaches, le premier groupe-cible sur lequel a été pratiquée l’ICSI.

Tout d’abord, permettez-moi de vous résumer les faits. Les vaches laitières donnent des veaux de race laitière, jusqu’ici pas de surprise. Sauf que la moitié de ces veaux sont des mâles qui, hélas, ont très peu de valeur économique. Pas de viande sur les os et pas de mamelle, donc pas de lait. Pour continuer à produire du lait, il faut pourtant que les vaches aient des veaux. Les chercheurs se sont donc rendus dans les abattoirs où ils ont prélevé les ovaires et les ovocytes de vaches à viande qui venaient d’être abattues. Les ovocytes ont été fécondés et vendus à des fermiers. Ces derniers, qui achetaient auparavant de la semence pour féconder leurs vaches, ont implanté les embryons de ces petites vaches à viande dans leurs vaches laitières. Les fermiers ont ainsi eu des vaches gestantes, qui allaient donner du lait après le vêlage, et un veau qui, si c’était un mâle, rapporterait tout de même de l’argent. C’est ainsi que sont nés ces veaux, mais également l’ICSI.

Cependant, lors de la fécondation des ovocytes par les spermatozoïdes, d’autres substances ont été ajoutées, causant le « syndrome du gros veau », veaux naissant avec des anomalies aux organes et au cerveau. D’une part, aucune substance n’est ajoutée en ICSI équine et, d’autre part, aucun problème touchant les poulains nouveau-nés n’a été rapporté. Le taux de réussite est toutefois supérieur chez les vaches, ce qui pourrait amener à conclure que la reproduction chez les bovins est moins sélective que chez les équins. Chez les bovins, la nature n’élimine pas les « erreurs de fabrication » qui naissent donc avec leurs anomalies. Cela ne semble pas être le cas chez les chevaux. Cela n’est pas vraiment une information nouvelle, du reste. Ainsi, la conception chez les bovins est assez simple, un jeu d’enfant comparé à la même procédure chez les chevaux.

Mais où en étions-nous ? Ah oui. Les premiers produits des juments et les porteuses. S’il s’agit de la première gestation de la porteuse, le poulain sera en dessous de la moyenne pour les mêmes raisons qu’avec sa mère biologique. Les mêmes travaux ont montré qu’un poulain issu de la gestation d’une jument suitée avait des performances supérieures à la moyenne. Dans ce cas, l’explication est sans doute à chercher dans l’état de santé général de la jument qui a un poulain par an. Pour compliquer encore les choses, il est également apparu que le produit d’une jument de trois ans avait généralement des performances supérieures à la moyenne. Pourquoi ? Les propriétaires d’une bonne jument ont envie de lui faire faire un poulain avant qu’elle commence sa carrière sportive et soit éventuellement vendue. En règle générale, les bons chevaux sont plus performants.

L’influence des mères porteuses est négligeable ! Bon, pas totalement, mais j’ai réussi à piquer votre intérêt ! Comme je l’ai dit plus haut, s’il s’agit de la première gestation de la porteuse, on sait que, statistiquement, le poulain sera moins performant que la moyenne.

Il serait toutefois injuste et injustifié de considérer les juments porteuses avec inquiétude, surtout s’agissant du caractère. Trois exemples :

Au polo, l’énergie et la volonté du cheval sont des facteurs décisifs. Les meilleurs constituent des atouts essentiels pour leur équipe et ne sont donc pas à vendre. La plupart de ces chevaux sont du reste des juments car, affirment les joueurs, les hongres ne font pas preuve de la même générosité. Quant aux entiers, on ne les utilise pas au polo parce qu’entiers et juments… oui, vous voyez l’idée. Les meilleures juments ne sont donc pas orientées vers la reproduction « traditionnelle » mais font du transfert d’embryons. Et ce n’est pas tout. En Argentine, ils clonent à gogo et les résultats parlent d’eux-mêmes. La jument Cuartetera du joueur légendaire Adolfo Cambiaso a été clonée six fois. Dans le monde du polo, elle est décrite comme le Messi de ce sport ; en la clonant,  Cambiaso s’est constitué un piquet dans lequel il n’a qu’à piocher pour continuer le match avec un cheval plus frais sans changement de tempérament. Avec ses six clones, il a remporté le prestigieux Open de Tortugas, à Palermo. Selon lui, c’est un luxe inouï de monter le « même » cheval et d’obtenir le même niveau d’engagement tout le temps.

Dans les courses de galop, la frontière entre anonymat et gloire éternelle est très mince. On dit souvent que c’est le tempérament qui fait la différence entre victoire et défaite, entre la première place et une place dans le peloton. Quiconque connaît un peu ce monde a certainement entendu dire qu’une cuisante défaite peut briser le mental d’un cheval et mettre fin à sa carrière. Lorsqu’une bonne jument pur-sang est suitée, il faut bien sûr qu’elle soit  à nouveau saillie. Les étalons pur-sang, qui ne font que la monte naturelle, ne sont pas toujours stationnés dans le même pays ni sur le même continent que les juments qui leur sont adressées. Il est hors de question de faire faire de longs voyages en camion ou, pire, en avion à ces tout jeunes poulains. C’est pourquoi il existe des nurseries à proximité des haras. Dans ces centres d’adoption, les foals sont élevés par des mères nourricières qui s’occupent d’eux. Il est évident que les éleveurs de pur-sang ne prendraient pas le risque de priver des foals issus de saillies à parfois 100 000 euros de la transmission du tempérament si précieux de leur championne de mère. Il semble donc que le tempérament de la mère adoptive n’influence en rien celui du poulain.

La dernière anecdote vient du professeur Daels lui-même. Il est généralement admis que les étalons marquent fortement le tempérament de leurs produits, en bien ou en mal. Pourtant, ces étalons n’étaient pas présents à la conception du foal. Ni à la naissance. Et ils ne sont pas venus les voir à la maternité non plus. Pourtant, les poulains héritent d’une partie du tempérament de leur père. C’est une histoire toute simple qui donne à penser.

ICSI ou TE

Dans les deux cas, il y aura transfert d’embryon. La seule différence concerne la phase qui précède le transfert proprement dit de l’embryon. Dans le cas d’un TE classique, l’ovocyte est fécondé dans la jument donneuse ; dans le cas de l’OPU/ICSI, la fécondation a lieu en laboratoire. La dernière étape consiste à implanter l’embryon dans la jument receveuse.

Si l’on en juge par les résultats, une OPU/ICSI offre de meilleures chances d’implantation d’un embryon que le TE classique. Pour le TE, les chances d’avoir un embryon sont de 35% en moyenne tandis que, avec l’ICSI, le taux de réussite dépasse les 60%. Cependant, une ICSI est considérablement plus onéreuse qu’un TE. L’ICSI permet plus de contrôle et plus de latitude que le TE qui reste dépendant du cycle naturel. Cependant, n’oublions pas que, pendant les années, le TE a été l’unique solution pour faire reproduire des juments de sport pendant leur carrière. Le TE présente d’autre part moins de risques que l’ICSI qui se pratique sous anesthésie péridurale et implique de percer la paroi vaginale. C’est pourquoi on pratique très peu d’OPU sur les juments de sport en cours de carrière. Il est évident que les deux techniques vont évoluer de façon significative avec le temps et que de plus nombreux centres d’ICSI vont ouvrir. Une offre plus importante va forcément entraîner une baisse des tarifs qui rendra l’ICSI plus attractive.

Enfin, on constate que l’ICSI comme le TE donnent plus de poulains que de pouliches. En moyenne, le TE produit 56% de mâles tandis que, avec l’ICSI, la moyenne monte à 72%. Dame Nature, elle, persiste à faire 50/50. A vous de choisir.

 

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